Çoğu virüsün genomik dizileri bilinmektedir.Tamamlayıcı viral DNA veya RNA segmentleri ile hibritleşmek üzere tasarlanmış kısa DNA segmentleri olan nükleik asit probları.Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), viral tespit için daha etkili bir tekniktir.Son zamanlarda yüksek verimli tanı yöntemleri geliştirilmiştir.
A. Nükleik asit hibridizasyon tekniği
Esas olarak Southern blot (Güney) ve Northern blot (Northern) içeren nükleik asit hibridizasyonu, virüs teşhis alanında hızla gelişen yeni bir tekniktir.Hibridizasyon testinin mantığı, tamamlayıcı viral DNA veya RNA segmentleri ile hibritleşmek üzere tasarlanmış kısa DNA segmentlerini (“sonda” olarak adlandırılır) kullanmaktır.Isıtma veya alkali muamelesi ile, çift sarmallı hedef DNA veya RNA, tek sarmallara ayrılır ve daha sonra katı bir destek üzerinde hareketsiz hale getirilir.Daha sonra prob eklenir ve hedef DNA veya RNA ile hibridize edilir.Prob, izotop veya radyoaktif olmayan nüklid ile etiketlendiğinden, hedef DNA veya RNA, otoradyografi veya biotin-avidin sistemi ile tespit edilebilir.Viral genomların çoğu klonlanmış ve dizilenmiş olduğundan, numunede problar olarak virüse özgü diziler kullanılarak tespit edilebilirler.Şu anda, hibridizasyon yöntemleri şunları içerir: nokta lekesi, hücrelerde yerinde hibridizasyon, DNA lekesi(DNA) (Güney lekesi) ve RNA lekesi(RNA) (Kuzey lekesi).
B.PCR Teknolojisi
Son yıllarda, duyarsız veya üretilemeyen virüsleri test etmek için PCR'ye dayalı bir dizi in vitro nükleik asit amplifikasyon tekniği geliştirilmiştir.PCR, in vitro polimeraz reaksiyonu ile spesifik DNA dizisini sentezleyebilen bir yöntemdir.PCR işlemi, üç adımlı bir termal döngü içerir: denatürasyon, tavlama ve uzatma Yüksek sıcaklıkta (93℃~95℃), çift sarmallı DNA, iki tek DNA sarmalına ayrılır;daha sonra düşük sıcaklıkta (37℃~60℃), iki sentezlenmiş nükleotid primeri tamamlayıcı DNA segmentlerine tavlanır;Taq enzimi için uygun sıcaklıkta (72℃), yeni DNA zincirlerinin sentezi, şablon olarak tamamlayıcı DNA ve malzeme olarak tek nükleotidler kullanılarak primer 3' ucundan başlar.Böylece her döngüden sonra bir DNA zinciri iki zincire yükseltilebilir.Bu işlemi tekrarlayarak, bir döngüde sentezlenen her DNA zinciri bir sonraki döngüde şablon olarak kullanılabilir ve her döngüde DNA zincirlerinin sayısı iki katına çıkar, yani PCR üretimi 2n log hızında çoğaltılır.25 ila 30 döngüden sonra, PCR üretimi elektroforez yoluyla tanımlanır ve spesifik DNA ürünleri UV ışığı (254nm) altında gözlemlenebilir.Spesifikliği, duyarlılığı ve uygunluğu nedeniyle PCR, HCV, HIV, CMV ve HPV gibi birçok viral enfeksiyonun klinik tanısında benimsenmiştir.PCR çok hassas olduğundan, virüs DNA'sını fg düzeyinde tespit edebilir, yanlış pozitifliği önlemek için işlem çok dikkatli yapılmalıdır.Ayrıca nükleik asit testinde pozitif sonuç, numunede canlı bulaşıcı virüs olduğu anlamına gelmez.
PCR tekniğinin geniş uygulaması ile farklı test amaçları için PCR tekniğine dayalı yeni teknikler ve yöntemler geliştirilmektedir.Örneğin, gerçek zamanlı nicel PCR viral yükü saptayabilir;in situ PCR, doku veya hücrelerdeki virüs enfeksiyonunu tanımlamak için kullanılır;Yuvalanmış PCR, PCR'nin özgüllüğünü artırabilir.Bunlar arasında gerçek zamanlı kantitatif PCR daha hızlı geliştirilmiştir.TaqMan hidroliz probu, hibridizasyon probu ve moleküler işaret probu gibi birçok yeni teknik, klinik araştırmalarda yaygın olarak kullanılan gerçek zamanlı kantitatif PCR tekniğinde birleştirilmiştir.Bu yöntem, hastaların vücut sıvılarındaki viral yükün doğru bir şekilde belirlenmesinin yanı sıra, ilaca toleranslı mutantı tespit etmek için de kullanılabilir.Bu nedenle, gerçek zamanlı kantitatif PCR esas olarak iyileştirici etki değerlendirmesi ve ilaç toleransı sürveyansında uygulanır.
C. Viral nükleik asitlerin yüksek verimli tespiti
Yeni ortaya çıkan bulaşıcı hastalıkların hızlı teşhisine yönelik ihtiyaçları karşılamak için, DNA çipleri (DNA) gibi çeşitli yüksek verimli tespit yöntemleri kurulmuştur.DNA çipleri için, spesifik problar sentezlenir ve numune ile hibridize edilebilen DNA prob mikrodizisini (DNA) oluşturmak için çok yüksek yoğunlukta küçük silikon çiplere bağlanır.Hibridizasyon sinyali, konfokal mikroskop veya lazer tarayıcı ile görüntülenebilir ve bilgisayar tarafından daha fazla işlenebilir ve farklı genlerle ilgili büyük veri seti elde edilebilir.İki çeşit DNA çipi vardır."Sentez çipi" aşağıdaki gibidir: spesifik oligonükleotitler, doğrudan çipler üzerinde sentezlenir.Bir diğeri ise DNA havuz çipidir.Klonlanmış genler veya PCR ürünleri, slayt üzerine düzenli olarak yazdırılır.DNA çip teknolojisinin avantajı, büyük miktarda DNA dizisinin eş zamanlı tespitidir.Patojen tespit çipinin en son sürümü, aynı anda 1700'den fazla insan virüsünü tanımlayabilir.DNA çip teknolojisi, geleneksel nükleik asit hibridizasyon yöntemlerinin sorunlarını çözmüştür ve viral tanı ve epidemiyolojik çalışmalarda çok geniş uygulamalara sahiptir.
Gönderim zamanı: Aralık-23-2020